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Azure Sapphire™NIR-Q使多重Western blotting標準化變得輕而易舉

現代數字檢測儀器對于western blotting不僅僅是檢測“有或沒有”的技術，還可以進行western blotting重復性和定量的檢測。在檢測方法的線性動態范圍，對數據進行標準化以控制蛋白上樣量和膜轉印帶來的變化，可以獲得真正的定量結果。 但是，對蛋白印跡進行標準化的**方法是什么？ 過去，金標準標準化方法是使用看家蛋白，基于這些蛋白在不同實驗條件下和細胞系中表達一致的假設。 然而，*近的研究表明，這種假設并不總是正確的，導致相對蛋白豐度的測量結果不準確。 相反，定量Western blotting專家和他們發表的期刊正在推薦一種新的金標準用于標準化，總蛋白定量 - 通過在膜上染色，檢測每個泳道的總蛋白進行標準化分析。

Azure Biosystems™的Sapphire™NIR-Q多功能激光生物分子成像系統具有兩個用于近紅外熒光檢測（700nm和800nm）的通道和用于檢測總蛋白專用的第三通道，使多重Western blotting標準化變得輕而易舉。

您可以繼續使用相同的NIR染料，同時加入總蛋白質染色劑，例如我們的低背景和易于使用的AzureRed試劑。 無需剝離和重孵育能夠檢測兩種不同的蛋白和總蛋白信號。

> 定量更準確

> 檢測更靈活

> 平臺設計更靈活

> 模塊化設計

使用看家蛋白進行標準化

使用看家蛋白**缺點是在樣品間和不同條件下表達水平可能不一致。如使用看家蛋白進行標準化，必須先花費時間和精力來驗證蛋白的選擇，并且可能需要檢查多種潛在的標準品，然后才能找到一種在所有樣品中真正表達同一水平，并且在不同實驗條件下不會發生變化的標準品。

使用看家蛋白的第二個重大挑戰是它們的表達豐度很高，如果樣品中的看家蛋白表達非常高，這會限制在凝膠上加載的樣品量，因為需要保留看家蛋白在線性檢測范圍內并且不會使看家蛋白的信號飽和。 如果感興趣的蛋白不是同樣高度表達，這兩種蛋白質不在同一線性檢測范圍內。

如果您正在進行多重蛋白印跡，例如比較同一蛋白質的磷酸化和非磷酸化形式，則需要考慮的第三個挑戰是從不同物種中產生一抗和二抗的復雜性。

*后，檢測的看家蛋白可能干擾感興趣蛋白的檢測。理想情況下，看家蛋白應該與感興趣蛋白的大小不同，因此這兩種蛋白可在印跡上空間分辨。 當實驗在同一印跡上檢查多種目的蛋白時，這變得越來越困難。

圖1.與常見的看家蛋白相比，AzureRed具有更寬的線性動態范圍

單色通道圖像A）AzureRed染色總蛋白B）Tubulin C）β-action和D）GAPDH。 AzureRed信號的優異動態范圍

與實際加載的蛋白量顯示在圖像（A）中。使用AzureSpot軟件定量來自總蛋白和看家蛋白的信號，并將得到的值

相對于每個樣品加載的蛋白量（E）作圖。與常見的看家蛋白相比，AzureRed表現出更強的相關性和更廣泛的動態范圍。

使用總蛋白進行標準化

使用總蛋白標準化，不是試圖找到可以代表轉移到膜上的樣品總量的蛋白，而是直接在膜上測量總蛋白，并且該值在標準化時用作分母。許多總蛋白染色劑可用于染色凝膠和膜。總蛋白染色提供更寬的動態范圍，并且表現出比看家蛋白更低的可變性和更清楚的數據。

總蛋白標準化比使用看家蛋白質快得多，特別是對于化學發光印跡，因為相對于剝離和重孵育染色步驟花費較少的時間。 理想情況下，在免疫檢測之前或之后，在膜上進行總蛋白染色。使用一些染色劑如AzureRed Fluorescent Total Protein Stain，可以在免疫檢測前對印跡進行染色，然后與目的蛋白同時對總蛋白進行成像。 通過這種*簡單的工作流程，目的蛋白和總蛋白的圖像會自動對齊。

與使用看家蛋白相比，圖像捕獲后的分析工作流程基本不變；整個泳道或泳道中大部分信號用于標準化，而不是單一的條帶。

用總蛋白染色劑對膜進行染色提供了額外的質控優勢，可以驗證轉印是否完全。

使用AzureRed進行的總蛋白質標準化很容易適合任何蛋白質印跡工作流程